کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

۱- مقدمه

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا^[۱] توانایی جداسازی و شناسایی ترکیبات موجود در یک مخلوط را با استفاده از فاز متحرک مایع (حلال) و فاز ساکن جامد (ستون) دارا می‌باشد. این روش بر اساس قطبیت فاز ساکن به دو دسته فاز نرمال^[۲](فاز ساکن قطبی) و فاز معکوس^[۳](فاز ساکن غیرقطبی) و بر اساس مکانیسم جداسازی به انواع جذب سطحی^[۴]، تعویض یون^[۵] و طرد اندازه^[۶] (این روش‌ها در مقاله مبانی کروماتوگرافی شرح داده شده‌اند) تقسیم‌بندی می‌شوند.

۲- اجزاء دستگاه HPLC

همانطور که در شکل ۱ مشاهده می‌کنید دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شامل اجزاء زیر می‌باشد:

     ۱. مخزن حلال^[۷]

     ۲. پمپ^[۸]

     ۳. سیستم تزریق^[۹]

     ۴. ستون^[۱۰]

     ۵. آشکارساز^[۱۱]

شکل ۱- شمایی از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و اجزاء آن

۱. حلال:

حلال در HPLC باید بسیار خالص بوده که بدین منظور از فیلترهای مخصوصی عبور داده می‌شوند و باید گاززدایی شده باشند تا حباب‌های گاز محلول در آنها، در سیستم آشکارساز اختلال ایجاد نکرده و باعث پهن‌شدگی پیک نشوند. از متداول‌ترین حلال‌ها می‌توان به متانول، استونیتریل و آب اشاره نمود. عبارت شویش در کروماتوگرافی به معنای عبور دادن اجزاء نمونه از میان ستون از طریق افزودن مداوم فاز متحرک می‌باشد که به فاز متحرک اصطلاحا شوینده^[۱۲] می‌گویند. دو نوع شویش داریم:

• شویش ایزوکراتیک^[۱۳]:در این روش ترکیب فاز متحرک چه از نظر قطبیت و چه از نظر ماهیت در طی فرایند شویش تغییر نمی‌کند. این روش زمانی مناسب است که اجزاء جداشونده دارای قطبیت‌های به اندازه کافی متفاوت از یکدیگر باشند.
• شویش گرادیانی (شیبی)^[۱۴]:در این روش ترکیب و قطبیت فاز متحرک در فرایند شویش تغییر می‌کند، به عبارتی از چند حلال با نسبت‌های معین که در فرایند شویش قابل تغییر است استفاده می‌شود. این روش زمانی مناسب است که تعداد زیادی اجزاء با دامنه وسیعی از قطبیت وجود داشته باشد.

۲. پمپ:

از مهم‌ترین پمپ‌ها می‌توان به پمپ‌های رفت و برگشتی یا پیستونی اشاره کرد. استفاده از پمپ‌ها به منظور عبور فاز متحرک و نمونه با سرعت و جریان ثابت از میان فاز ساکن می‌باشد.

۳. سیستم تزریق:

فشار عملیاتی دستگاه HPLC به اندازه کافی بالا است که نمی‌توان مثل کروماتوگرافی گازی به صورت مستقیم به آن تزریق نمود. بر این اساس تزریق نمونه در Loop صورت می‌گیرد که در شکل۲ مشاهده می‌کنید. با توجه به شکل ابتدا نمونه در Loop که در رنج حجمی ۰/۵ میکرولیتر تا ۵ میلی‌لیتر است و از فاز متحرک (بخش سبز رنگ) جدا می‌باشد، بارگذاری شده (بخش آبی رنگ) و اضافه آن به ضایعات منتقل می‌شود. سپس به حالت تزریق نمونه تغییر داده و در معرض فاز متحرک قرارگرفته و وارد ستون می‌شود. محل تزریق نمونه نیز در شکل ۳-ب آورده شده است که به صورت دستی انجام میگیرد (شکل ۳-پ). همچنین  در صورت داشتن تعداد نمونه بالا مخصوصا در بخش‌های تحقیقاتی از سیستم تزریق اتوماتیک (شکل ۳-آ) استفاده میگردد.

شکل ۲- شمایی از سیستم تزریق نمونه

شکل ۳- (آ) سیستم تزریق اتوماتیک. (ب) نمایی از سیستم تزریق دستگاه. (پ) سیستم تزریق دستی

۴. ستون:

روند جداسازی به صورت شماتیک در شکل ۴ آورده شده است. همانطور که مشاهده می‌کنید حلال نمونه کمترین برهمکنش را با فاز ساکن داشته و زودتر از سایر ترکیبات به آشکارساز می‌رسد. ترکیبات دیگر نیز با توجه به میزان برهمکنش آنها با فاز ساکن که در بیشتر موارد بر اساس قطبیت آنها انجام می‌شود، در ستون جداسازی می‌شوند و هر کدام یک نوار (band) را در ستون تشکیل می‌دهند. هر دسته از این ترکیبات پس از خارج شدن از ستون و رسیدن به آشکارساز با یک پیک در کروماتوگرام نشان داده می‌شوند و ماهیت هر پیک با استفاده از زمانی که به آشکارساز می‌رسد مشخص می‌شود. همچنین میزان غلظت هر ترکیب با استفاده از اندازه سطح زیر پیک یا ارتفاع پیک قابل اندازه‌گیری است. گفتنی است زمان بازداری هر نمونه در صورت ثابت بودن تمامی پارامترها در جداسازی، ثابت بوده و با مقایسه آن با نمونه استاندارد،آنالیت مجهول قابل شناسایی و اندازه‌گیری کمی می‌باشد.

شکل ۴- در شکل به ترتیب شماره نشان‌دهنده ورود نمونه و جداسازی آن به وسیله ستون و در نهایت رسیدن آنها به آشکارساز و نمایش پیک‌ها در کروماتوگرام و شناسایی بر اساس زمان جداسازی و تعیین غلظت بر اساس سطح زیر پیک

۱.۴- روش‌های توصیف کارایی ستون:

در توصیف کارایی ستون از دو تئوری استفاده می‌شود:

• تئوری بشقابک‌های فرضی: نتایج تحقیقات نشان می‌دهند که پدیده‌های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی بر روی سرعت جداسازی و همچنین پهنای باند هر آنالیت تاثیر دارد. در این تئوری فرض می‌شود که هر ستون از یک سری لایه‌های باریک، افقی و کاملا مجزا که به طور متوالی قرارگرفته‌اند تشکیل شده است. به هر یک از این لایه‌ها بشقابک گفته می‌شود که در هرکدام، آنالیت در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابک‌ها عمل جداسازی صورت می‌گیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابک‌های موجود در ستون (تعداد تعادل‌ها) بستگی دارد. تعداد بشقابک‌های فرضی N از رابطه زیر قابل محاسبه است که در آن H ارتفاع بشقابک و Lطول ستون را نشان می‌دهد.

علاوه براین، N  را می‌توان با استفاده از عرض پیک در کروماتوگرام و زمان بازداری طبق رابطه زیر تعیین نمود:

در رابطه (۲)، w عرض پیک در کروماتوگرام و t_R زمان بازداری پیک مربوطه است.

t_R مدت زمانی است که طول می‌کشد تا آنالیت پس از تزریق به ستون، به آشکارساز برسد. این مدت زمان به میزان برهمکنش بین مولکولی وابسته بوده که انواع آن در شکل ۵ آمده است:

شکل ۵- نمونه‌ای از انواع برهمکنش‌های بین مولکولی نمونه با فاز ساکن

فاز متحرک نیز در زمان بازداری نمونه بسیار تاثیرگذار می‌باشد؛ همان‌طور که در شکل (۶) مشاهده می‌کنید، هم در زمان و هم در شکل پیک تفاوت زیادی ایجاد خواهد کرد:

شکل ۶- تاثیر اثر حلال بر زمان بازداری و شکل پیک

• تئوری سرعت: در تئوری قبلی امکان توصیف علت پهن‌شدگی پیک وجود نداشت. به این علت تئوری سرعت تحت عنوان معادله وان دیمتر مطرح شد:

در این معادله H ارتفاع بشقابک فرضی، A نفوذ گردابی^[۱۵]، B/u عبارت نفوذ طولی^[۱۶] و Cu عبارت انتقال جرم^[۱۷] است. نفوذ گردابی، بیانگر این است که در اثر عبور مولکول‌های ماده مورد تجزیه از میان ستون، آنها می‌توانند مسیرهای مختلفی را در اطراف ذرات فاز ساکن انتخاب کنند و در نتیجه برخی از آنها مسیر کوتاهتر و برخی مسیر طولانی‌تری طی می‌کنند که این اختلاف مسیر باعث پهن شدگی پیک می‌شود. در شکل (۷) تاثیر نفوذ طولی در پهن شدن پیک در کروماتوگرام نمایش داده شده است.

شکل ۷- تاثیر نفوذ طولی در پهن شدن پیک در کروماتوگرام

عبارت نفوذ طولی، به نوعی یک فرایند تعویض باند است که در اثر نفوذ آنالیت از مرکز باند به سمت‌های رقیق‌تر جلو و عقب نوار یعنی همسو و در جهت عکس با مسیر جریان فاز متحرک ایجاد می‌گردد. این عبارت با سرعت فاز متحرک نسبت عکس دارد، یعنیهر چه سرعت فاز متحرک بیشتر باشد، نفوذ طولی کمتر شده در نتیجه پهن‌شدگی کمتر می‌شود.

عبارت انتقال جرم، بیانگر انتقال مولکول‌های آنالیت به طور مداوم بین فاز متحرک و ثابت بر طبق نسبت توزیع آن بوده و فقط در مرز بین دو فاز رخ می‌دهد. در این عبارت هرچه سرعت فاز متحرک کمتر باشد، انتقال جرم بهتر انجام شده و پهن‌شدگی کمتر اتفاق میافتد.

بر اساس پارامترهای ذکر شده سرعت جریان مطلوب (optimum) بر اساس معادله زیر بدست می‌آید که نمودار آن در شکل۸ آورده شده است:

شکل ۸- نمودار تعداد بشقابک‌های فرضی بر حسب سرعت خطی فاز متحرک و تعیین سرعت مطلوب فاز متحرک

۲.۴- انواع ستون در HPLC:

• ستون‌های تجزیه‌ای: این ستون‌ها وظیفه اصلی جداسازی را بر عهده دارند. طول آنها ۱۰-۵۰ سانتی‌متر و قطر داخلی ۴-۱۰ میلی‌متر دارند. جنس آنها فولاد زنگ نزن بوده و قطر ذرات پرکننده در حدود چند میکرومتر است. ذرات پرکننده آن می‌توانند ذرات لایه‌نشانی شده یا مواد متخلخل باشند.
• ستون‌های محافظ (گارد): این ستون‌ها تقریبا مشابه ستون‌های تجزیه‌ای بوده اما ذرات پرکننده آنها بسیار درشت‌تر و کوتاهتر می‌باشند. این ستون‌ها قبل از ستون تجزیه‌ای قرار گرفته و نقشی در جداسازی ندارند. به کارگیری آنها به دلایلی همچون حذف ناخالصی از حلال و آنالیت، اشباع کردن فاز متحرک از فاز ساکن و افزایش طول عمر ستون تجزیه ای می‌باشد.

۵. آشکارسازها:

نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز شده و با دریافت هر جزء از اجزای نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید می‌کند که پس از فرستاده شدن به یک دستگاه رسام، کروماتوگرام نمونه رسم می‌شود که همچنین شدت هر پیک مربوط به هر ترکیب با مقدار کمی آن جزء متناسب است. از نظر تئوری یک آشکارساز زمانی در شرایط ایده‌آل و بهینه قراردارد که بتواند تمام اجزاء نمونه را به محض خروج از ستون تشخیص داده و متناسب با غلظت هر جزء یک سیگنال تولید کند. پس سرعت پاسخ‌گویی و حساسیت یک آشکارساز مهم‌ترین خصوصیت آن می‌باشد. انواع آشکارسازهای HPLC عبارتند از:

• آشکارساز ضریب شکست
• آشکارساز UV-Vis
• آشکارساز جذب زیرقرمز FTIR
• آشکارساز فلورسانی
• آشکارسازهای الکتروشیمیایی
• آشکارسازهای طیف‌سنج جرمی
• آشکارسازهای هدایت‌سنجی

۳- نانوفناوری در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

معرفی نانومواد به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی مایع به دلیل سطح و خصوصیات ساختاری این دسته از مواد در کنار توانایی آنها در برقراری برهمکنش خاص با آنالیت‌ها، مزایای بیشماری در این زمینه ایجاد کرده است. این جنبه‌ها پیشرفت‌های مهمی را در زمینه کارایی، گزینش پذیری و افزایش رزولوشن و همچنین توسعه بیشتر سیستم‌های کوچک مینیاتوری امکان‌پذیر کرده، که این امر باعث کاهش مصرف حلال و ساده‌سازی پروسه جداسازی شده است.

بر اساس آماده‌سازی فاز ساکن دو دیدگاه وجود دارد. از یک سو بسیاری از محققان توجه خود را به تهیه ستون‌هایی متمرکز کرده‌اند که در آن به دلیل آماده‌سازی هم‌زمان^[۱۸]، نفوذپذیری زیاد، شیمی سطح گسترده در دسترس و خاصیت تخلخل خوب؛ نانومواد به ماده دیگری که به عنوان تکیه‌گاه استفاده می‌شود (معمولا ذرات ریز سیلیکا یا پوشش‌های یکپارچه پلیمری)، متصل می‌شوند. از طرفی دیگر، اگرچه کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرد؛ نانومواد جزء اصلی فاز ساکن بدون هیچگونه اصلاح سطح بوده و به عنوان پوششی برای اجزاء خاص عمل می‌کنند. در هر دو مورد نوع نانومواد مورد استفاده بسیار متنوع است. بدین منظور، نانو مواد آلی و معدنی یا انواع مواد کربنی مانند نانولوله کربنی، گرافن و فولرین در میان دیگر مواد به دلیل کاربرد مناسب آنها به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی ارزیابی شدند.

۴- کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در آنالیز نانومواد

روش HPLC در آنالیز نانو مواد نیز کاربرد دارد. همانطور که در شکل ۹ مشاهده می‌کنید، برای شناسایی فولرن C₆₀ و  C₇₀ از اتصال (کوپل شدن) HPLC با دیگر روش‌های آنالیز (^[۱۹]FT-IR)؛ بر اساس برنامه شویش ایزوکراتیک با ستون غیرقطبی C18 و مخلوط استونیتریل-تولوئن (۱:۱) به عنوان فاز متحرک استفاده شده است. با داشتن زمان خروج نمونه استاندارد و مقایسه آن با زمان خروج نمونه از ستون می‌توان شناسایی کیفی را انجام داد و همچنین با بدست آوردن سطح زیر پیک، غلظت نمونه را می‌توان اندازه گیری کرد (شناسایی کمی).

شکل ۹- کروماتوگرام HPLC-FT-IR نمونه فولرن [۳]

۵- جمع‌بندی و نتیجه‌گیری

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله روش‌های جداسازی پرکاربرد در بسیاری از علوم است. این روش دارای انواع فاز نرمال و فاز معکوس، زوج یون، جذب سطحی، تعویض یونی و طرد اندازه می‌باشد. دستگاه آن شامل بخش‌های مختلف بوده که مهم‌ترین آن ستون بوده که عمل جداسازی در آن اتفاق می‌افتد. فناوری نانو در زمینه انواع فاز ساکن به هدف بهبود گزینش پذیری و کارایی ستون و همچنین در آنالیز نانومواد ورود پیدا کرده است. در این روش با استفاده از زمان بازداری و سطح زیر پیک امکان شناسایی کمی و کیفی مخلوط ترکیبات وجود دارد.

برای مطالعه مطالب علمی بیشتر به صفحه مقالات آموزشی سایت باشگاه نانو مراجعه نمایید.

۶- منابع

[1] کتاب راهنمای آموزشی مهارت های عملی آزمایشگاهی: کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC . نویسنده الیزابت پریچارد. مترجم الهه کنوز.

[2] Practical High-Performance Liquid Chromatography Fifth Edition. Veronika R.Meyer

[3] Analysis of C and C fullerenes using high-performance liquid 60 70 chromatography–Fourier transform infrared spectroscopy, J.M. Treubig, P.R. Brown / J. Chromatogr. A 960 (2002) 135–142

۷- پاورقی

[1] High Performance Liquid Chromatography

[2] Normal Phase Chromatography

[3] Reverse Phase Chromatography

[4]Adsorption Chromatography

[5] Ion exchange chromatography

[6] Size exclusion chromatography

[7]HPLC Solvent

[8] Pump

[9] Injector

[10] Column

[11] Detector

[12] Eluent

[13] Isocratic elution

[14] Gradient elution

[15]Eddy diffusion

[16] Molecular diffusion

[17] Mass transfer

[18]in situ preparation

[19] Fourier Transform Infrared Spectroscopy