مبانی اولیه کروماتوگرافی

۱- مقدمه

کروماتوگرافی^[۱] برای اولین بار در سال ۱۹۰۰ توسط دانشمند ایتالیایی میخائیل تسو^[۲] در روسیه به کار گرفته شد. وی در دهه اول قرن بیستم کروماتوگرافی را در وهله اول برای جداسازی رنگدانه‌های گیاهی مثل کلروفیل، کاروتن و زانتوفیل‌ها به کار گرفت. از آنجا که این ترکیبات دارای رنگ‌های مختلف (سبز، نارنجی و زرد) هستند، اسم این روش به کروماتوگرافی معروف شد.

انواع جدید روش‌های کروماتوگرافی که در دهه ۱۹۳۰ و ۱۹۴۰ توسعه یافتند، این روش را به روشی کارآمد در بسیاری از فرایند‌های جداسازی تبدیل کرده‌اند. روش کروماتوگرافی به دلیل تلاش‌های آرچر جان پورت مارتین^[۳] و ریچارد لورنس میلینگتون سینگ^[۴] در طول دهه ۱۹۴۰ و ۱۹۵۰ به طور چشم‌گیری توسعه یافت که منجر به دریافت جایزه نوبل شیمی در سال ۱۹۵۲ شد. آنها اصول و روش‌های اساسی کروماتوگرافی تقسیمی را که سبب توسعه چندین روش کروماتوگرافی مانند: کروماتوگرافی کاغذی، کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شد، بنا نهادند. در حال حاضر این روش به سرعت در حال پیشرفت است و محققان به طور مداوم در حال بهبود عملکرد فنی آن هستند و هم‌اکنون امکان جداسازی مولکول‌های مشابه بیشتری را فراهم می‌کنند[۱-۴].

۲- اصطلاحات کروماتوگرافی:

• آنالیت^[۵]: ترکیبی است که مد نظر و مورد شناسایی ما بوده و باید از مخلوط جداسازی شود.
• فاز متحرک^[۶]: فازی است که نمونه را در طول جداسازی با خود حمل می‌کند و می‌تواند بسته به نوع روش به شکل گاز یا مایع باشد.
• فاز ساکن^[۷]: فازی است که با پیوندی از نوع کووالانسی به ذرات پشتیبان یا به درون دیواره ستون کروماتوگرافی متصل شده‌اند و می‌تواند بسته به نوع روش به شکل جامد یا مایع باشد.
• کروماتوگرام^[۸]: یک خروجی بصری به شکل یک نمودار است که از ترسیم پاسخ آشکارساز به صورت تابعی از زمان یا حجم فاز متحرک حاصل می‌شود. نمونه‌ای از این نمودار در شکل (۱) نمایش داده شده است.

شکل۱- شمایی از کروماتوگرام[۵]

• آشکارساز^[۹]: اشاره به ابزاری دارد که برای آشکار‌سازی کمی و کیفی آنالیت‌ها بعد از جداسازی مورد استفاده قرار می‌گیرند.
• زمان بازداری^[۱۰]: مدت زمانی است که طول می‌کشد تا آنالیت به آشکارساز برسد و شناسایی شود. این زمان در کروماتوگرام با t_R نشان داده می‌شود.
• زمان مرده^[۱۱]: زمان بازداری یک گونه فرضی است که اصلا در فاز ساکن نگه داشته نمی‌شود. به عبارتی t_M زمان بازداری فاز متحرک است که در نمودار شکل (۱) نیز مشاهده می‌شود.
• ثابت توزیع^[۱۲]: نسبت غلظت گونه در فاز ساکن به غلظت گونه در فاز متحرک است. هرچه مقدار k بیشتر باشد یعنی زمان ماندگاری در فاز ساکن بیشتر بوده و دیرتر شناسایی می‌شود. K را می‌توان بصورت زیر نوشت:

که C_s غلظت گونه در فاز ساکن و C_m غلظت گونه در فاز متحرک است.

۳- روش‌های کروماتوگرافی:

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان براساس معیارهای مختلف تقسیم‌بندی نمود، این معیارها شامل چگونگی تماس فازمتحرک و ساکن، حالت فیزیکی فاز متحرک و یا مکانیسم جداسازی می‌باشد که در ادامه به معرفی روش‌های مختلف کروماتوگرافی که بر اساس هر یک از این سه معیار دسته‌بندی شده‌اند، خواهیم پرداخت.

۱-۳- تقسیم‌بندی از نظر چگونگی تماس فاز متحرک و ساکن

روش‌های کروماتوگرافی بر اساس چگونگی تماس فاز متحرک و ساکن به دو دسته کلی کروماتوگرافی ستونی و مسطح تقسیم‌بندی می‌شوند. کروماتوگرافی مسطح نیز خود شامل کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک است، که در ادامه به معرفی هریک از این روش‌ها خواهیم پرداخت.

• کروماتوگرافی ستونی^[۱۳]: در این روش فاز ساکن در درون لوله باریک به نام ستون تثبیت شده و سپس فاز متحرک از درون ستون به کمک نیروی گرانش یا یک نیروی خارجی حاصل از پمپ عبور می‌کند. مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا $\mathrm{HPLC}$^[۱۴] و کروماتوگرافی گازی^[۱۵] [۶،۷]. همانطور که در شکل (۲) مشاهده می‌کنید برای جدا کردن یک مخلوط با کروماتوگرافی ستونی؛ ستون را با جسم جامد فعال (فاز ساکن) مانند آلومینا یا سیلیکاژل پر کرده و کمی از نمونه مایع را روی آن بارگذاری می‌کنند (شماره۱). سپس حلال استخراج کننده‌ای را در داخل ستون جریان می‌دهند (شماره۲). این فاز مایع متحرک اجزای مخلوط را با خود حمل می‌کند ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز ساکن، اجزای مخلوط می‌توانند با سرعت‌های مختلفی به پایین ستون حرکت کنند (شماره۳). ترکیبی که با نیروی ضعیف‌تری جذب فاز ساکن می‌شود زودتر از ستون خارج میگردد (شماره ۴و۵).

شکل۲- شمایی از کروماتوگرافی ستونی[۸]

• کروماتوگرافی مسطح^[۱۶]: فاز ساکن روی یک سطح مسطح (می‌تواند کاغذ باشد "کروماتوگرافی کاغذی" و می‌تواند لایه‌ای از ذرات جامد باشد که روی یک تکیه‌گاه پخش می‌شوند"کروماتوگرافی لایه نازک") قرار گرفته است و فاز متحرک از طریق نیروی موئینگی یا یک نیروی خارجی از داخل فاز ساکن عبور می‌کند. ترکیبات مختلف موجود در مخلوط نمونه با توجه به شدت تعامل آنها با فاز ساکن نسبت به فاز متحرک مسافت‌های مختلفی را طی می‌کنند. عامل خاص نگهداري (R_f) هر ماده شيميايي مي‌تواند براي شناسايي يك ماده ناشناخته مورد استفاده قرارگيرد. همانطور که در شکل (۳) مشاهده می‌کنید و با توجه به رابطه (۲) به طور مثال R_f برای لکه آبی رنگ ۰/۸ می‌باشد که می‌توان با مقایسه این عدد با میزان پیش‌روی نمونه استاندارد؛ در صورت یکسان بودن مابقی عوامل تاثیرگذار نتیجه گرفت که این دو نمونه یکسان هستند و شناسایی را انجام داد. (X در رابطه (۲) مسافت طی شده روی سطح می‌باشد).

شکل۳- مفهوم Rf وشمایی از کروماتوگرافی مسطح [۹]

• کروماتوگرافی کاغذی^[۱۷]: کروماتوگرافی کاغذی شامل قراردادن یک نقطه یا خط کوچک از محلول نمونه بر روی نوار کاغذ کروماتوگرافی است. کاغذ در یک ظرف با لایه کم عمق حلال قرارداده شده و مهروموم می‌شود. هر چه حلال از طریق کاغذ بالا می‌رود، به مخلوط نمونه رسیده و شروع به حرکت به سمت بالا می‌کند. این کاغذ از جنس سلولز، یک ماده قطبی ساخته شده و بنابراین اگر ترکیبات درون مخلوط قطبیت کمتری داشته باشند، مسافت بیشتری را روی کاغذ حرکت می‌کنند. مواد قطبی نیز با کاغذ سلولز سریع‌تر پیوند برقرار کرده و در کاغذ حرکتی نمی‌کنند.

• کروماتوگرافی لایه نازک ($\mathrm{TLC}$)^[۱۸]: یک روش آزمایشگاهی است که به طور گسترده برای جدا کردن ترکیبات مختلف بر اساس جاذبه‌های نسبی آنها به فاز ساکن و متحرک، مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش شبیه به کروماتوگرافی کاغذی است. با این حال، به جای یک فاز ساکن کاغذ، از یک لایه نازک جاذب مانند سیلیکا ژل، آلومینا یا سلولز روی یک بستر مسطح و بی‌اثر استفاده می‌شود (شکل(۵)). مزیت این روش در مقایسه با کروماتوگرافی کاغذی؛ اجرای سریع‌تر، جداسازی بهتر، تجزیه و تحلیل کمی بهتر و انتخاب بین جاذب‌های مختلف که منجر به انتخاب‌پذیری بهتر نسبت به اجزاء مختلف مخلوط می‌شود؛ می‌باشد[۱۱].

در این روش نیز با داشتن میزان جابه‌جایی فاز متحرک (Xحلال) و جابه‌جایی استاندارد نمونه^[۱۹] از یک سو به صورت مرجع و از سوی دیگر با تکرار آزمایش برای نمونه مجهول و میزان جابه جایی آن (X نمونه)؛ آنالیت مورد نظر را شناسایی کرد.

شکل۵- ساختار یک جاذب پوشیده شده با آلومینا و نحوه جداسازی آنالیت[۱۲]

۲-۳- تقسیم‌بندی بر اساس حالت فیزیکی فاز متحرک

روش‌های کروماتوگرافی براساس حالت فیزیکی فاز متحرک به دو دسته کروماتوگرافی گازی و مایع تقسیم می‌شوند، که در ادامه به معرفی این دو روش خواهیم پرداخت.

• کروماتوگرافی گازی ($\mathrm{GC}$)^[۲۰]: این روش که به عنوان کروماتوگرافی گاز- مایع ($\mathrm{GLC}$)^[۲۱] نیز شناخته می‌شود (شمای کلی دستگاه در شکل (۶) آمده است)؛ یک روش جداسازی است که درآن فاز متحرک یک گاز است. این روش مناسب گونه‌هایی است که نقطه جوش پایین داشته (کمتر از ۵۰۰ درجه سانتی‌گراد) و یا از نظرحرارتی پایدار هستند. جداسازی کروماتوگرافی گازی همیشه در یک ستون انجام می‌شود که به طور معمول "پرشده" و یا "موئینه" هستند. ستون‌های پرشده، ستون‌های معمول کروماتوگرافی گازی هستند که ارزان‌تر بوده و دارای کارکرد راحت‌تر هستند و اغلب عملکرد کافی را دارند. ستون‌های موئینه معمولاً وضوح به مراتب بالاتری دارند و گرچه گران‌تر هستند؛ به خصوص برای مخلوط‌های پیچیده، بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرند. هر دو نوع ستون از مواد غیرجاذب و شیمیایی بی اثر ساخته شده است. کروماتوگرافی گازی مبتنی بر ضریب تقسیم آنالیت بین فاز ساکن جامد یا مایع ویسکوز (اغلب یک ماده سیلیکونی مایع) و یک گاز متحرک (اغلب هلیوم) است. این روش به طور گسترده در شیمی تحلیلی مورد استفاده قرار می‌گیرد. گرچه درجه حرارت بالا مورد استفاده در GC، آن را برای بیوپلیمرهای با وزن مولکولی بالا یا پروتئین‌ها مناسب نمی‌کند (گرما آنها را تخریب می‌کند)، اما برای استفاده در پتروشیمی، نظارت بر محیط زیست و زمینه‌های شیمیایی صنعتی مناسب است. همچنین در تحقیقات شیمی بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرد.

شکل۶- شمایی از کروماتوگرافی گازی[۱۳]

• کروماتوگرافی مایع ($\mathrm{LC}$)^[۲۲]: یک روش جداسازی است که در آن فاز متحرک یک مایع است که می‌تواند آنالیت را در ستون یا سطح حمل کند (شمای کلی دستگاه در شکل(۷) آمده است). کروماتوگرافی مایع امروزی که در آن از ذرات پرکننده بسیار ریز و از فشار نسبتاً بالایی استفاده می‌شود، به عنوان کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یاد می‌شود. در HPLC نمونه توسط مایع در فشار زیاد (فاز متحرک) از طریق ستونی با یک فاز ساکن متشکل از ذرات به شکل نامنظم یا کروی در یک لایه یکپارچه متخلخل؛ حمل می‌شود. HPLC از نظر تاریخی بر اساس قطبیت فاز ساکن و متحرک به دو گروه تقسیم‌بندی می‌شود:^[۲۳]

1. کروماتوگرافی مایع با فاز عادی ($\mathrm{NPLC}$)^[۲۴] که در آن فاز ساکن قطبی‌تر از فاز متحرک باشد (به عنوان مثال، تولوئن به عنوان فاز متحرک، سیلیس به عنوان فاز ساکن)
2. کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس ($\mathrm{RPLC}$)^[۲۵] که در آن فاز متحرک قطبی‌تر از فاز ساکن باشد (به عنوان مثال، مخلوط آب و متانول به عنوان فاز متحرک، C18 (اکتادسیلسیلین) به عنوان فاز ساکن)

شکل۷- شمایی از کروماتوگرافی مایع[۱۴]

۳-۳- تقسیم‌بندی بر اساس مکانسیم جداسازی

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان براساس مکانیسم جداسازی نیز تقسیم‌بندی نمود که از بین آنها به سه دسته کروماتوگرافی جذب سطحی، تعویض یونی و غربالی میتوان اشاره کرد، که در ادامه به معرفی آنها خواهیم پرداخت.

• کروماتوگرافی جذب سطحی^[۲۶]: نمونه‌ای از کروماتوگرافی جامد – مایع است که درآن جداسازی مواد به علت متفاوت بودن جذب سطحی اجزاء مختلف مخلوط و فاز ساکن انجام می‌گیرد. سرعت حرکت هر جزء‏، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب، ماده‌ای که کم جذب شده است، سریع‌تر از ماده‌ای که زیاد جذب شده است، حرکت می‌کند. واضح است که اگر اختلاف بین جذب‌های سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد بصورت کامل انجام خواهد گرفت. اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که کمتر جذب می‌شوند در قسمت‌های پایین ستون، جذب خواهند شد.

• کروماتوگرافی تعویض یونی^[۲۷]: فاز متحرک مایع و فاز ساکن معمولا یک رزین است که خاصیت تبادل یون دارد. نوع تعادل، تعویض یون‌های آنالیت با یون‌های رزین است. بنابراین، این روش برای جداسازی اجزاء یونی یا گونه‌هایی که بتوان به نحوی آنها را به یون تبدیل کرد، مناسب است. همانطور که در شکل(۸) مشاهده می‌کنید استفاده از رزین با بار مثبت توانایی جذب پروتئین باردار شده منفی را داشته و می‌تواند آن را جداسازی کند.

رزین‌ها (جاذب‌های مصنوعی) از ذرات پلیمری متقاطع کروی ساخته شده‌اند (شکل(۹))، که دارای ساختار متخلخل(پر حفره) هستند. جذب ترکیبات به جاذب‌های مصنوعی بیشتر ناشی از برهمکنش آب‌گریزی بین ترکیبات و جاذب‌ها می‌باشد. رزین‌های تعویض یون دارای انواع کاتیونی (اسیدی) مثل گروه (R-COOH و R-SO₃H) برای جداسازی کاتیون‌ها و آنیونی (بازی) مثل گروه (⁺R-NH₃^-Cl) برای جداسازی آنیون‌ها هستند. به طور مثال در جاذب‌های اسیدی گروه COOH به بستر Rمتصل هستند که به ^-COO تبدیل می‌شوند. حال این جاذب توانایی جذب یک کاتیون به طور مثال نقره ⁺Ag را دارد و جداسازی صورت می‌گیرد.

شکل۸- شمایی از کروماتوگرافی تعویض یون[۱۵]

شکل۹- شمایی از یک رزین

• کروماتوگرافی طرداندازه (غربالی)^[۲۸]: در این روش فاز ساکن، مایعی است که در میان حفرات یک بستر پلیمری محبوس شده است. نوع تعادل بر اساس غربال اندازه است به گونه‌ای که بستر پلیمری دارای حفرات با اندازه مشخص بوده که به مولکول‌ها با اندازه معین اجازه می‌دهد به این حفرات راه پیدا کنند و پس از ورود به این حفرات مابین فاز ساکن توزیع شوند. پس در این روش ابتدا مولکول‌های درشت‌تر از ستون خارج شده و سپس مولکول‌های ریزتر (شکل(۱۰)). این روش برای مولکول‌های با جرم مولکولی بالا مثل پلیمرها استفاده می‌شود.

شکل۱۰- شمایی از کروماتوگرافی طرد اندازه[۱۵]

۴- جمع‌بندی و نتیجه‌گیری

کروماتوگرافی یکی از متداول‌ترین روش‌های جداسازی و شناسایی مواد است. امروزه کروماتوگرافی کاربرد وسیعی در بسیاری زمینه‌ها شامل شیمی، داروسازی، پتروشیمی، مواد غذایی و ... پیدا کرده است. روش‌های کروماتوگرافی در جداسازی مخلوط ترکیبات، شناسایی ترکیبات ناشناخته، تخمین خلوص و غلظت مواد، نظارت در تولید دارو در صنایع داروسازی و ... کاربرد بسیاری دارند. در کروماتوگرافی، جداسازی بر اساس تمایل اجزا یک نمونه بین دو فاز و اختلاف در سرعت مهاجرت گونه‌ها است، به صورتی که اختلاف کمی در ضریب تقسیم آنها بین فاز ساکن و متحرک منجر به تفاوت در زمان بازداری در فاز ساکن شده و باعث تاثیر در جداسازی می‌شود. در این مقاله توضیح کلی درباره مبانی اولیه کروماتوگرافی و انواع آن داده شد. در مقاله بعدی با مفاهیم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و کروماتوگرافی گازی آشنا می‌شویم و کاربرد فناوری‌نانو را بررسی خواهیم کرد.

برای مطالعه مطالب علمی بیشتر به صفحه مقالات آموزشی سایت باشگاه نانو مراجعه نمایید.

۵- منابع

 [1] Ettre LS, Zlatkis A, eds. (26 August 2011). 75 Years of Chromatography: A Historical Dialogue. Elsevier. ISBN 978-0-08-085817-3.

[2] Ettre, L. S.; Sakodynskii, K. I. (March 1993). "M. S. Tswett and the discovery of chromatography II: Completion of the development of chromatography (1903–1910)". Chromatographia. 35 (5–6): 329–338. doi:10.1007/BF02277520

[3]  "The Nobel Prize in Chemistry 1952". nobelprize.org. Retrieved 25 August 2016.

[4]  "The Importance of Laboratory Testing for Cannabis Products". 25 October 2018. Archived from the original on 14 November 2018. Retrieved 14 November 2018.

[5] https://community.asdlib.org/imageandvideoexchangeforum/2013/08/01/retention-time-baseline-width-and-void-time/

[6] Ettre, L. S. (1993). "Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993)". Pure and Applied Chemistry. 65 (4): 819–872. doi:10.1351/pac199365040819

[7] T, Manish. "How does column chromatography work?". BrightMags. Archived from the original on 21 April 2017. Retrieved 7 April 2017.

[8] https://byjus.com/chemistry/column-chromatography/

[9] Wirnkor VA. Applications of Column, Paper, Thin Layer and Ion Exchange Chromatography in Purifying Samples: Mini Review. SF J Pharm Anal Chem. 2019; 2(2): 1018. ISSN 2643-8178.

[10]http://old.roshd.ir/Default.aspx?tabid=497&EntryID=7111&SSOReturnPage=Check&Rand=0

[11]Bernard., Fried (2003). Handbook of Thin-Layer Chromatography. Marcel Dekker Inc. ISBN 978-0824748661. OCLC 437068122.

[12] https://favpng.com/png_view/thin-layer-chromatography-adsorption-high-performance-liquid-chromatography-silicon-dioxide-png/01dsF0AY

[13] https://pediaa.com/how-does-gas-chromatography-work/

[14] chromatography  in Bioactivity Analysis of Compounds, SylwesterCzaplicki, April 2013, DOI: 10.5772/55620

[15] https://bitesizebio.com/29685/determine-molecular-weight-gel-filtration-chromatogram/

۶- پاورقی

[1] chromatography

[2]Mikhail Tsvet

[3]Archer John Porter Martin

[4]Richard Laurence Millington Synge

[5] Analyte

[6] mobile phase

[7] stationary phase

[8] Chromatogram

[9] Detector

[10] Retention time

[11] Dead time

[12]Partition coefficient

[13] Column chromatography

[14] High Performance Liquid Chromatography

[15] Gas Chromatography

[16] Planar chromatography

[17] Paper chromatography

[18] Thin-layer chromatography

[19]استاندارد نمونه‌ای است خالص شده با غلظت معین و دقیق نمونه

[20] Gas chromatography

[21] Gas-Liquid Chromatography

[22]Liquid chromatography

[23]Partition chromatography

[24] Normal-Phase Liquid Chromatography

[25] Reversed-Phase Chromatography

[26]Adsorption Chromatography

[27] Ion exchange chromatography

[28] Size exclusion chromatography